Как определить коэффициент поляризации у осетровых
Искусственное воспроизводство русского осетра включает в себя следующие биотехнические процессы:
— преднерестовое содержание производителей,
— получение половых продуктов,
— отмывка оплодотворенной икры,
— выдерживание свободных эмбрионов,
— перевод молоди на смешанное и активное питание,
— подращивание молоди до трёх грамм.
Как правило, осетровые заводы заготавливают производителей русского осетра во время нерестовых миграций, однако в последнее время заготовить таким методом производителей русского осетра становится все проблематичней из за малочисленности природных стад. В связи с этим стали заготавливать особей старших возрастных групп в море с последующей доместикацией в прудовых ,бассейновых и садковых условиях и содержать их до половозрелости.
Отлов производителей и особей старших возрастных групп осуществляют закидными неводами или сетями в низовьях рек. В некоторых районах , в которых в последние годы наблюдается слабый заход осетра в реки, осетра отлавливают ставными неводами в приустьевых участках моря.
Отловленных особей осетра осматривают и отбирают по размерам, весу и состоянию рыбы. При отборе производителей обращают внимание на внешние признаки. Самцы, как правило тоньше и прогонистее самок. У близких к зрелости самок половое отверстие бывает припухшее и покрасневшее, что не наблюдается у самцов. Кроме того рыбоводы используют рекомендации М.Ш. Гусейнова по отбору особей с завершенной IV стадией зрелости половых желёз:
· у самок тонкая тешка, овал их брюшка отчетливо выражен, а брюшная стенка мягкая;
· хвостовой стебель у производителей относительно тонкий, а его высота значительно больше ширины;
· при изгибе тела у производителей хорошо проступает под кожей сегментация мускулатуры, что не наблюдается у особей менее зрелых.
Помимо указанных визуальных признаков, при помощи которых у производителей определяют завершенную IV стадию зрелости половых желез, можно также установить состояние гонад самок методом непосредственного анализа ооцитов. Для этого используют щуп, которым берут из яичника самки пробу. Для этого используют щуп, которым отбирают пробу из яичника самки. Из пробы отбирают 3 — 5 икринок и фиксируют их в кипящей воде.
Рис. 1.1 Схема поляризации ядра ооцита русского осетра
АП — анимальный полюс; ВП — вегетативный полюс.
1 — ооцит на четвертой стадии зрелости.
2 — ооцит на четвертой завершенной стадии зрелости.
3 — ооцит в стадии начальной резорбции.
В течение 1-2 минут, после чего икринки разрезают бритвой по вегетативно- анимальной оси, под лупой определяют положение ядра и рассчитывают коэффициент поляризации ядра. Если ядро находится у оболочек в зоне микропиле, то ооцит взят из яичника самки завершенной IV стадии зрелости. Если ядро отстоит менее чем на свой диаметр от оболочек, то ооцит близок к завершению IV стадии зрелости. Если ядро расположено на расстоянии 1,5 — 2 своих диаметров от оболочек, то ооцит находится на IV незавершенной стадии зрелости. При центральном расположении ядра, ооцит находится на III стадии зрелости.
Отобранных производителей рассаживают на преднерестовое содержание раздельно по полу в специально подготовленные земляные садки Куринского типа, пруды Казанского или стеклопластиковые бассейны, а также в цех Казанского с рециркуляционной системой водоснабжения и регулируемой температурой воды. Неполовозрелые особи высаживаются в пруды или бассейны на одомашнивания.
При наступлении устойчивых температур воды , для русского осетра 12 — 14 о С, производители русского инъецируются гонадотропными гормонами (суспензия гипофиза осетровых) или искусственными препаратами (сурфагон, нерестин)с целью вызова овуляции у самок и спермации у самцов. При проведении инъекций необходимо очень бережно обращаться с рыбой. Возбуждение и травмирование производителей, а также ухудшение условий содержания должны быть исключены, так как всё это снижает качество половых продуктов. Подбор дозы препарата проводится индивидуально для каждого производителя, учитывая степень поляризации ядра ооцита, температуры и сроки преднерестового содержания производителей.
После инъекций самцы становятся зрелыми раньше самок. Поэтому самцам вводят гонадотропный гормон после инъецирования самок, что дает возможность одновременно получать зрелых производителей обоих полов.
При появлении первых овулировавших икринок, при лёгком надавливании брюшка в области генитального отверстия, самку готовят к операции.
Отбор овулировавшей икры осуществляют прижизненно (по методу Подушки), самку усыпляют анестетиком (раствор лидокаина, бензокаина, гвоздичного масла), после чего проводят нарезание яйцеводов и отцеживают икру. Как правило, таким методом получают 80 — 85% икра от общего ее содержания в самке. После получения икры приступают к отбору спермы методом отсасывания шприцами. Перед оплодотворением, качество спермы оценивается по пятибалльной шкале.
Рис. 1.2 Икра на начальных стадиях развития
В процессе инкубации постоянно осуществляется контроль за термическим, гидрохимическим режимами и эмбриональным развитием. Эмбриональное развитие русского осетра длится 5-7 суток, в зависимости от температуры воды.
В процессе инкубации исключительно важное мероприятие — удаления неоплодотворенных и мертвых икринок, так как на мертвой икре интенсивно развивается сапролегния, гифы которой могут закрывать близлежащие живые икринки, что приводит к их гибели. Для борьбы с сапролегнией устраивают систематическое купание икры в лечебных растворах (метиленовой сини 1:50000, трехпромильный раствор поваренной соли, фиолетового «К»).
Рис 1.3 Предличинка массового выклева (стадия 35-36)
На 36 стадии развития начинается массовый выклев, при котором предличинка выбирается из инкубационного аппарата в личинкосборник, где выдерживается в течении двух дней, до деловой личинки.
Для выдерживания предличинок и выращивания молоди русского осетра применяют круглые бетонные бассейны различного типа — Бассейн ВНИРО, бассейн конструкции П.А.Улановского, бассейн «Южкаспрыбводаыбвода», а также стеклопластиковые бассейны.
Плотность посадки предличинок составляет от 5 до 10 тыс.шт/м 3 . При расходе воды 3-4 л/мин., и содержание кислорода в воде не ниже 8-9мг/л.
Предличинок не кормят, так как они питаются за счет содержимого желточного мешка. После завершения эмбрионального периода развития начинается личиночный период жизни. К этому времени желточный мешок сокращается на 2/3 от первоначальной его массы и личинка переходит на смешанное питание. Визуально определить переход личинок на смешанное питание можно по их поведению. Р. Ю. Касимов утановил, что изменение реакции личинок на свет, которое наступает на 2-3 дня раньше, чем они начинают рассеиваться и перестают образовывать скопления, совпадает с началом смешанного питания. Время перехода личинок на активное зависит от температуры воды, так русский осетр при температуре воды 14-16 о С переходит на активное питание в возрасте 13-15 дней, а при температуре воды 16-20 О С на7-8 день. Перешедших на смешанное питание личинок начинают кормить рубленными олигохетами и мелким зоопланктоном ( моиной, дафнией, артемией) Перешедшую личинку на активное питание при средней массе 300-500мг, пересаживают на выращивание до трех грамм в другие бассейны и пруды.
Таблица 1.3 Биотехнические нормативы по получению Рыбопосадочного материала русского осетра
Преднерестовое содержание производителей
Температура воды при выдерживании, о С
Соотношение производителей перед получением половых продуктов(самки : самцы),
Продолжительность наполнения бассейна водой, мин
Продолжительность спуска воды из бассейна, мин
Расход воды на 100 кг рыбы, л/с
Получение половых продуктов
Температура в период гормональной стимуляции, о С
Масса производителей, кг:
Созревание самок после гипофизарной стимуляции, %
Выживаемость после получения половых продуктов, %
Относительная рабочая плодовитость самок, тыс. шт. икринок / кг
Среднее количество икринок в 1 г сцеженной икры, шт
Масса одной икринки, мг
Определение процента осеменения икры на стадии 2-4 бластомеров, ч:
Инкубация икры
Температура воды в период инкубации, о С
Продолжительность инкубации, сут.
Выход предличинок из инкубационного аппарата, %
Масса однодневных предличинок, мг
Выдерживание предличинок до перехода на активное питание
Плотность посадки в бассейны, тыс. шт/м 3
Личинок, перешедших на активное питание
Масса личинок, перешедших на активное питание, мг
Температура воды, о С
Кратность полного водообмена в бассейне, раз / ч
Продолжительность выдерживания предличинок до перехода на активное питания, сут
chebanov_m_s_galich_e_v_rukovodstvo_po_iskusstv
Для расчета коэффициента поляризации, не менее 10 ооцитов, извлеченных от каждой самки, фиксируют путем кипячения в физиологическом растворе в течение двух мин. или выдерживают в течение двух часов в жидкости Серра (смесь96%спирта, 40%формалинаиледянойуксуснойкислотывсоотношении 6:3:1). Более удобно фиксировать ооциты путем их обработки паром в течение трех мин. После фиксации, для предотвращения высыхания препарата, ооциты должны находиться в физиологическом растворе. Фиксированные ооциты разрезают в меридиональном направлении (посредине)и изучают под бинокуляром, оснащенным окуляр-микрометром (Рисунок 55).
Рисунок 55: Разрезанный ооцит под бинокуляром.
Основным показателем, определяемым на разрезах ооцитов, является коэффициент поляризации (К п ). Для его вычисления на разрезе измеряют наибольшее расстояние от анимального до вегетативного полюса (L ) и расстояние от анимального полюса до верхнего края ядра (зародышевого пузырька)( l ),послечегорассчитываюткоэффициентполяризации(отношение l /L). Толщиной оболочек при этом пренебрегают (Рисунок 56).
Рисунок 56: Схематичное изображение ооцита осетровых рыб в разрезе.
Таким образом, коэффициент поляризации (К п ) определяется по формуле:
где, l -расстояниеотанимальногополюсадоверхнегокраяядра(зародышевого пузырька), а L — наибольшее расстояние от анимального до вегетативного полюса (Рисунок 56).
Примеры ооцитов с различным коэффициентом поляризации представлены на Рисунке 57.
Рисунок 57: Ооциты с различными значениями коэффициента поляризации.
Следует отметить, что наличие пигмента в желтке ооцита свидетельствует о начале резорбции.
Для расчёта коэффициента поляризации с точностью 0,01 м в исследовательских целях, Ван Эненнаам и др. (Van Eenennaam et al. 1996) использовали микроскоп «Микротон» с камерой люцида и портативным цифровым анализатором изображений (Nicon Microplan II). Родина (Rodina, 2006) для этих целей использовал бинокулярный микроскоп Zeiss STEMI 2000-C, оснащенный адаптером к цифровой камере (Olympus Camedia C2000 ZOOM)сподключениемквидеомонитору.Приэтомдлялучшейвизуализации разрезанные ооциты наблюдались погружёнными в дисцилированную воду в чашках Петри, а для обработки результатов использовалось программное обеспечение для анализа изображений. Использование цифрового оборудования позволяет проводить обработку большого числа образцов ооцитов с высокой точностью.
4.4.2.2 Группировка и определение потенциальных производителей
Для оптимизации использования производителей (самок), их делят на группы на основании полученных результатов определения коэффициента поляризации (Таблица 9).
Таблица 9: Группы самок по показателю коэффициента поляризации К п и рекомендации по их использованию.
Рекомендации по использованию
отсаживаются на нагул
при достижении нерестовых температур
немедленно инъецируются любым
при достижении нерестовых температур
могут выдерживаться в течение 2–3
суток, анадромные виды рекомендуется
инъекции проводятся после выдерживания
при нерестовых температурах 7–14 суток
выдерживаются при нерестовых температурах
20–40 суток перед инъекцией
отсаживаются на нагул
После разделения производителей на группы осуществляется планированиедальнейшихрыбоводныхработ.Самкиизвторойитретьейгрупп могут в дальнейшем использоваться без повторной биопсии. Коэффициент поляризации ооцитов самок из четвёртой-пятой групп исследуют повторно, в зависимости от расчетного времени их готовности. Рыбы пятой группы, у которых показатель поляризации ооцитов не изменился, после выдерживания при нерестовых температурах в течение 14–21 суток, относятся к категории незрелых и отсаживаются на нагул.
4.4.2.3Использованиепродолжительностисозреванияооцитовосетровых рыб in vitro для отбора зрелых самок – тест «разрушение зародышевого пузырька»
Гончаров(1981;Goncharov,1993)предложилиспользоватьпродолжительность созревания ооцитов (время, в течение которого ядро (зародышевый пузырек) мигрирует к анимальному полюсу и разрушается) in vitro в присутствии гормонов, стимулирующих созревание (прогестерон или его метаболиты, прогестины), как более эффективный критерий оценки готовности самок к гормональной инъекции чем К п . Было также выявлено, что, если созревание ооцитов длится более 18 τ 0 (τ 0 – продолжительность митотического цикла в период синхронных делений дробления), то рыбоводная икра, полученная после гормональной стимуляции, как правило, низкого качества. Значения τ 0 при различных температурах инкубации для понто-каспийских видов можно рассчитать с помощью кривой, приведенной в работе (Детлаф, Гинзбург и Шмальгаузен, 1981) (Приложение III).
Вийо, Брюн и Рурик (Williot, Brunand and Rooryck,1991) и Вийо и др. (Williot etal .,2002)показали,чтоиспользованиетолькоиндексаполяризации,с высокойвероятностью,приводиткошибкепригормональномстимулировании сибирского осетра A. baerii.
Позднее, подход для отбора самок, пригодных для воспроизводства на основе продолжительности созревания 50% ооцитов in vitro в присутствии прогестерона (T50), интенсивно развивался Гончаровым (Goncharov, 1993) и
Гончаровым и др. (Goncharov et al. , 2009).
Для диких самок севрюги ( A. stellatus ) и самок стерляди (A. ruthenus), выращиваемых в искусственных условиях, данный метод позволяет идентифицировать и не использовать для искусственного воспроизводства группы рыб, неспособных производить икру высокого качества в этом состоянии и при стандартных условиях гормональной стимуляции.
Этот метод был модифицирован Конте (Conte et al ., 1988) и Ван Эненнаамом, Бруком и Кроллом (Van Eenennaam, Bruch and Kroll, 2001) для белого осетра, а также Вийо, Брюном и Руриком (Williot, Brun and Rooryck, 1991) для сибирского осетра. Метод может быть обобщен в виде приведенной ниже методики проведения анализа компетентности ооцитов к созреванию in vitro:
1. Приготовить маточный раствор прогестерона, растворяя 10 мг прогестерона (4-pregnene-3, 20-dione) в 10 мл 96% этилового спирта. Маточный раствор может храниться при температуре 16 о С в сосуде с плотно закрытой крышкой.
2. ПодготовитьчетыречашкиПетридлякаждойсамки(двеконтрольных и две с прогестероном). Необходимое количество маточного раствора прогестерона (5 мкг/мл), составляющее 75 мкл (0,075 мл) следует добавить в раствор для инкубации ооцитов с помощью микропипетки илишприца(1мл)надносухойчашки.Послетого,какэтиловыйспирт
полностью испарился, следует добавить 15 мл модифицированного для холоднокровных животных раствора Рингера (6,5 г.NaCl, 250 мг KCl, 300 мг CaCl 2 и 2 г NaHCO 3 на литр дистиллированной воды) в каждую чашку с прогестероном (Гончаров, 1981). В контрольных чашках Петри должно находиться такое же количество (75 мкл) 96% этилового спирта. Для того чтобы избежать ошибок, необходимо использовать отдельные шприцы для прогестерона и контрольные (с этиловым спиртом) чашки. В том случае, если используются микропипетки, следует заменить их наконечники. Затем следует аккуратно потрясти чашки Петри для перемешивания раствора.
3. Пятнадцатьооцитов,извлеченныхизкаждойсамки,следуетпоместить в 20 мл пробирку, с помощью чистой одноразовой пластмассовой пипетки. Фоликулы должны быть полностью промыты в несколько приемов раствором Рингера. Затем необходимо с помощью пипетки изъять 5 мл раствора Рингера из чашки Петри, в которую помещаются ооциты. Следует аккуратно повернуть пробирку и вылить жидкость, содержащую ооциты обратно в чашку Петри (это необходимо для поддержания правильного объема раствора Рингера в каждой чашке Петри).
4. Записать время и провести инкубацию ооцитов в течение 18 τ 0 .
5. Следует отметить, что некоторые авторы (Doroshov et al., 1983; Conte
et al. , 1988; Parauka, 1993; Mohler, 2003) считают 24 ч. оптимальной продолжительностью инкубации ооцитов (15–16 о С) в случае выращивания северо-американских видов осетровых, в то время как другие (Van Eenennaam, Bruch and Kroll, 2001; Mims et al., 2002),
рекомендуют 16 ч. (при 16,0 + 0,5 o C и 23 o C соответственно).
6. После завершения инкубации, фолликулы фиксируются кипячением в воде или помещаются в жидкость Серра (Раздел 4.4.2.1). После этого фолликулы нужно немедленно охладить, поместив пробирки в лед на 30 мин. Как показали Ван Энненнам, Брук и Кролл (Van Eenennaam, Bruch and Kroll, 2001), у перезрелых самок обычно мягкие ооциты, даже после охлаждения, однако после содержания в буферном формалине в течение 24 ч. ооциты становятся более твердыми и легче разрезаются.
7. После этого, ооциты разрезаются вдоль оси, соединяющей анимальный и вегетативный полюсы (см. раздел, посвященный определению коэффициента поляризации) с помощью лезвия бритвы и дают оценку состояния зародышевого пузырька. Наличие или разрушениезародышевогопузырькадлякаждогоооцитаопределяется направлением луча света на поверхность разреза. Разрушение зародышевого пузырька, а также наличие неповрежденных ядер в ооцитах должно быть задокументировано.
8. Самки со 100% реакцией в растворе прогестерона и с наличием некоторой реакции в контрольных чашках, должны быть
проинъецированы примерно в течение одной недели. Самки со 100% реакцией в растворе прогестерона и с отсутствием реакции в контрольных чашках, должны быть проинъецированы примерно в течение двух недель. Самки, у 90–100% ооцитов которых наблюдается разрушениезародышевыхпузырьков,должныповторноисследоваться через 3–4 недели. Как отмечают Ван Энненнаам, Брук и Крол (Van Eenennaam, Bruch and Kroll, 2001), подобные оценки получены при содержании самок при температуре порядка 13–15 о С. При более низких температурах указанные периоды должны быть немного увеличены, а при более высоких температурах – соответственно уменьшены. Самки, у которых количество ооцитов с разрушением зародышевых пузырьков составляет менее 80%, представляются сомнительными кандидатами для гормонального стимулирования.
Следует отметить, что Вийо и др. (Williot , 1997) были протестированы различные среды для инкубации ооцитов. По мнению указанных авторов, применение некоторых сред, например, раствора Рингера, следует исключить, постольку они являются неполными по составу и очень нестабильны в отношении pH, что может привести к неверным результатам (для сибирского осетра). Поэтому Вийо и др. (Williot, 1997) настоятельно рекомендуют использовать среду, которая близка характеристикам крови сибирского осетра (так называемую, SIS), компоненты которой представлены в Таблице 10.
РЕЗУЛЬТАТЫ ДИАГНОСТИКИ ПОЛА И СТАДИЙ ЗРЕЛОСТИ ГОНАД ОСЕТРОВЫХ УЗИ-СКАНИРОВАНИЕМ И МЕТОДОМ БИОПСИИ
В статье представлен сравнительный анализ результатов диагностики пола и стадий зрелости гонад, проведенный двумя общепринятыми методами при выращивании маточного стада осетровых в условиях установки замкнутого водоснабжения ПНИЛ «Разведение ценных пород осетровых» ФГБОУ ВО Волгоградский ГАУ. Описаны собственные нормативы, обеспечивающие первое и последующее созревание маток, выявляемые с целью повышения эффективности созревания особей. Предложены характеристики поляризации яйцеклеток и собственная база эхограмм гонад, полученных при исследовании рыб, выращенных в определенных рыбоводно-биологических и гидрохимических условиях. Описаны особенности гонадогенеза и гаметогенеза осетровых в условиях проблемной научно-исследовательской лаборатории, выявлено значительное сокращение межнерестовых интервалов. Охарактеризована периодичность сроков созревания ремонтно-маточного стада.
Ключевые слова: УЗИ-сканирование рыб, метод биопсии гонад, коэффициент поляризации яйцеклеток, гонады осетровых, маточное стадо, рыбоводно-биологические нормативы, гидрохимические нормативы
Введение. Проблемная научно-исследовательская лаборатория «Разведение ценных пород осетровых» была основана на базе кафедры «Водные биоресурсы и аквакульту- ра» в сентябре 2014 г. Объект создан для проведения научно-исследовательских работ и в числе основных целей имеет улучшение качества половых продуктов осетровых рыб.
Целью исследования был анализ методов изучения функциональных изменений развития половых клеток (гаметогенеза), формирования и развития половых желез (го- надогенеза), прохождения годичных половых циклов, характера икрометания осетровых рыб в условиях УЗВ лаборатории «Разведение ценных пород осетровых» с применением биопсийного метода и метода УЗИ-сканирования. Выявление воздействия гидрологических факторов и особенностей кормовой базы на нерест, гаметогенез, половые циклы и проявившиеся при этом адаптивные способности.
Материалы и методы. С 2015 года в ПНИЛ «Разведение ценных пород осетровых» проводилась УЗИ-диагностика производителей. При этом отбирались особи 3-4 стадии зрелости гонад — самки стадии F4, самцы стадии М5-нерест. Оборудование — стационарный УЗИ-сканер MINDRAY DP-50 с ультразвуковыми линейными датчиками частотой 2-5 Мгц, используемыми для рыб массой 20-50 кг [9, 10, 7]. Биопсия проводилась по методике Б.Н. Казанского, Ю.А. Феклова и др. После сканирования методом УЗИ у самок щупом через боковые мышцы изымали ооциты и подвергали оценке зрелости. Тестировали только 3-4 стадию, выявляемую по УЗИ.
Для этого несколько извлеченных у самок ооцитов фиксировали путем кипячения в физиологическом растворе, разрезали и изучали под электронным USB микроскопом с подключением к PC. На разрезах определялся показатель — коэффициент их поляризации (Кп) [2, 8, 10]. Обследование проводилось на 10 икринках, полученных щупом от каждой особи.
Кп = l/L,
где L — наибольшее расстояние от анимального до вегетативного полюса; l — расстояние от ани- мального полюса до верхнего края зародышевого пузырька.
Для обработки результатов ультразвуковой диагностики пола и стадий зрелости гонад применялась классификация стадии и подстадий гонадогенеза Трусова [10]. Глубина сканирования устанавливалась — 5-6 см. При осмотре в поперечном направлении выявлялось положение генеративной ткани в гонаде на уровне 3-4 жучек. Первичный осмотр рыб проходил в апреле 2015 года в расчетное время созревания первых самок. Исследование на половую принадлежность проводили после выдерживания рыбы на диете для уменьшения скопления жира, усложняющего исследование (рисунок 1).
Рисунок 1 — А — Проведение УЗИ-диагностики аппаратом MINDRAY DP-50 в период осенней бонитировки. Б, В — Оценка зрелости яйцеклеток извлеченных от 5 самок — фиксация кипячением в физиологическом растворе, продольный разрез ооцитов и изучение под электронным USB-микроскопом [10]
Результаты и обсуждение. С целью повышения изучения эффективности созревания особей в УЗВ в ПНИЛ «Разведение ценных пород осетровых» велись наблюдения и выявлены собственные нормативы, обеспечивающие первое и последующее созревание РМС (таблица 1). Гидрохимические показатели определялись еженедельно индикаторами Tetra. Кормление маточного поголовья осуществлялось гранулированными кормами Aller Aqua и Coppens.
Таблица 1 — Рыбоводно-биологические и гидрохимические нормативы, полученные в УЗВ ПНИЛ «Разведение ценных пород осетровых» для выращивания производителей ленского осетра
Таким образом, в исследованиях по определению особенностей созревания гонад осетровых и выяснения характеристик их годичных изменений в условиях УЗВ мы учитывали не только макро- и микроскопические данные, но и физиологическое состояние организма рыб, кормление и абиотические факторы прохождения жизненных циклов [1, 3, 4].
По результатам УЗИ-диагностики сибирского (ленской популяции) и русского осетров в УЗВ замечено, что обычно гонада хорошо видна, ее минимальный линейный размер на срезе превышает длину ультразвуковой волны [10]. Таким образом, в условиях лаборатории сформирована собственная база эхограмм (рисунок 2, таблица 2).
Таблица 2 — Результаты УЗИ-диагностики гонад сибирского осетра ПНИЛ «Разведение ценных пород осетровых»
Биопсийным методом определения стадий зрелости яйцеклеток осетровых были получены результаты (таблицы 3, 4), где расчетом коэффициента поляризации маток разделили на группы. III-IV стадии зрелости гонад достигла одна самка русского осетра, которая направлена на выдерживание при нерестовых температурах в течение 10 суток и с постепенным выходом, т.е. с ежедневным повышением t на 2 градуса.
Таблица 3 — Расчеты коэффициента поляризации ооцитов осетровых ПНИЛ «Разведение ценных пород осетровых»
Рисунок 2 — Фронтальный срез. Ткани и органы в порядке от сканирующей поверхности:
1. Кожа — тонкая гиперэхогенная зона. 2. Подкожная жировая клетчатка, зона средней эхогенности. 3. Мышечная ткань — широкая зона смешанной эхогенности, на которой собственно мышечная ткань (средней яркости) чередуется с миомерами из соединительной ткани (наклонные, почти вертикальные более яркие, чем мышцы узкие полосы).
4. Серозная оболочка брюшной полости — яркая ровная четкая граница. 5. Собственно гонада (2 стадия зрелости) имеет структуру различной эхогенности. 6. Кишечник — обычно полая трубка [9, 10, 7]
Еще одна самка отправлена на выдерживание с более длительным периодом 3035 суток до начала иньецирования. Ее Кп относится к категории — способные к созреванию, — и стадия зрелости гонад определяется как III. Все особи ленского осетра и еще две самки русского имеют коэффициент поляризации в пределах 0,2-0,4, относятся к категории незрелые и отправляются в нагул, стадия зрелости II начало III.
Таблица 4 — Группы самок по показателю коэффициента поляризации Кп и рекомендации по их использованию [10]
Самки из второй и третьей групп (зрелые и близкие к созреванию) могут в дальнейшем использоваться без повторной биопсии, коэффициент поляризации ооцитов маток из 4-5 групп (близкие к созреванию и способные к созреванию) исследуют повторно, в зависимости от расчетного времени их готовности [6]. Рыбы 5-й группы, у которых показатель поляризации ооцитов не изменился, после выдерживания при нерестовых температурах в течение 14-21 суток относятся к категории незрелых. Преднерестовое выдерживание должно осуществляться при нерестовых температурах, без повышения температуры воды выше оптимальной даже на непродолжительное время. B условиях ПНИЛ созревание ооцитов и овуляция контролируется воздействием синтетического гормонального препарата «Сypфaгoн».
Заключение. В целом диагностикой пола и стадий зрелости гонад осетровых УЗИ-сканированием и методом биопсии, в течение 3-х лет выявлено:
1. Сроки межнерестовых интервалов осетровых сокращены в 3 раза, по сравнению с аналогичными данными [8]. Вероятно, на созревание производителей наиболее активно влияет сумма эффективных температур (более 20 °С круглогодично) и использование комбинированных кормов с содержанием жира около 12 %.
2. Замечено, что самцы созревают ежегодно, доля самок, созревающих каждый год, составляет около 30 %. В период каждой бонитировки выявляется часть самок с задержкой развития гонад на 2 стадии зрелости. Замечено снижение созревания самок в осенний период. Какой-либо зависимости в динамике сроков созревания особей по годам исследования не выявлено.
3. В процессе исследований ни разу не определялся максимальный коэффициент зрелости, который характеризует период наибольшего развития гонад, у рыб с порционным икрометанием (осетровых).
4. Количество жира на гонадах осетров из УЗВ значительно выше, чем у особей, выращиваемых при естественных температурах в садковых хозяйствах, что связано также и с индивидуальным рационом для всех возрастных групп производителей.
1. Дикусаров, В.Г. Использование витаминно-минерального премикса при кормлении осетровых пастообразными кормами [Текст]/ В.Г. Дикусаров, Д.А. Ранделин // Инновационные технологии и ветеринарная защита при интенсивном производстве продукции животноводства: Материалы национальной конф. — Волгоград: ВолГАУ, 2016. — С. 305-310.
2. Калмыков, В.Г. Применение метода морфофизиологических индикаторов в исследовании самок стерляди, выращенной в условиях установки замкнутого водоснабжения [Текст]/ Калмыков В.Г., Дикусаров В.Г., Блинков Б.В. // Стратегические ориентиры инновационного развития АПК в современных экономических условиях: материалы Международной научно- практич. конф. — Волгоград: ВолГАУ, 2016. — С. 399-402.
3. Коротаева, О.С. Рост и развитие русского осетра при использовании интенсивной технологии выращивания [Текст]/ О.С. Коротаева, А.И. Густова // Стратегические ориентиры инновационного развития АПК в современных экономических условиях: материалы Международной научно-практич. конф. — Волгоград: ВолГАУ, 2016. — С. 322-325.
4. Кравченко, Ю.В. Оценка условий выращивания рыб в УЗВ на примере лаборатории «Разведение ценных пород осетровых» [Текст] / Ю.В. Кравченко, А.Р. Амирханян, В.Г. Дикусаров // Стратегические ориентиры инновационного развития АПК в современных экономических условиях: материалы Международной научно-практич. конф. — Волгоград: ВолГАУ, 2016. — С. 356-360.
5. Матишов, Г.Г. Опыт выращивания осетровых рыб в условиях замкнутой системы водо- обеспечения для фермерских хозяйств [Текст] / Г.Г. Матишов [и др.]. — Ростов на Дону: Изд.-во ЮНЦ РАН, 2006. — 72 с.
6. Мильштейн, В.В. Осетроводство [Текст] / В.В. Мильштейн. — М.: Пищ. пром-ть, 1982. — 150 с.
7. Осетровая УЗВ [Электронный ресурс]// Системные требования: http://belorybitsa.com/index.php/we_offer/ultrasound_diagnosis/ (дата обращения 13.12.2017)
8. Пономарёв, C.B. Осетpовoдствo на интенсивной основе [Текст] / C.B. ^шмарёв, Д.И. Иванов. — М.: ^лсс, 2009. — 312 c.
9. Руководство по ультразвуковой диагностике [Текст] / ВОЗ. — Женева, 2000. — 334 с.
10. Чебанов, М.С. Руководство по разведению и выращиванию осетровых рыб [Текст] / М.С. Чебанов, Е.В. Галич, Ю.Н. Чмырь. — М.: ФГНУ Росинформагротех, 2004. — 148 с.
"Известия нижневолжского агроуниверситетского комплекса" № 2 (50), 2018
Получение зрелых производителей осетровых рыб
Получение зрелых производителей, у которых икра и сперма пригодны для оплодотворения, — важнейший элемент работы по искусственному разведению осетровых.
Раньше получение таких рыб было возможно только вблизи мест естественного нереста или непосредственно на нерестилищах, где приходилось организовывать специальный лов. Из пойманных рыб лишь небольшая часть (не больше 1—4%) имела зрелую икру и сперму.
При таком ненадежном способе получения зрелых продуктов организация искусственного разведения в больших масштабах крайне затруднялась.
Экологический и физиологический методы стимулирования созревания половых продуктов
Для перевода осетроводства на плановую основу нужно было овладеть процессом перевода производителей в нерестовое состояние с целью получения зрелых яйцеклеток и такой же спермы.
Существует два способа решения этой задачи. Один из них — экологический — разработал академик АН АзССР А. Н. Державин. Он считал, что при выдерживании производителей следует создавать условия внешней среды, соответствующие естественным, в которых происходит развитие половых продуктов. Поскольку в природе икра и сперма созревают во время хода рыбы на нерест против течения воды, то этот фактор А. Н. Державин считал основным, влияющим на ускорение созревания половых продуктов. Он рекомендовал для выдерживания и получения зрелых производителей использовать овальные садки длиной 25 м, шириной 6 м и глубиной до 1,2 м, в которых создавалось течение и имитировались речные условия (быстротоки и т. д.). На дно таких садков насыпается галька. Водоснабжение в садке механическое, расход воды 20 л/с. Улучшение циркуляции воды достигается устройством в средней части садка по его длине бетонной стены протяженностью 19 м. В каждый садок помещают по 50 рыб; самок и самцов раздельно. Наряду с течением в садках создают благоприятный температурный и кислородный режим. Однако опыт работы с такими садками показал, что в них созревает только одна треть производителей, к тому же трудно определить момент, когда надо брать икру.
Этих недостатков лишен физиологический метод стимулирования созревания половых продуктов, разработанный профессором Н. Л. Гербильским. Он основан на введении ацетонированного препарата гипофиза в мышцы тела самки и самца, от которых хотят получить зрелую икру или сперму.
Исследования показали, что в организме рыбы важным регулятором созревания половых клеток является придаток мозга — гипофиз, связывающий нервную систему организма с половыми железами. Гипофиз — железа внутренней секреции — вырабатывает особые вещества — гормоны, под влиянием которых происходит переход производителей в нерестовое состояние.
Гипофиз состоит из двух частей: мозговой — нейрогипофиза и железистой — аденогипофиза. Гонадотропные гормоны вырабатываются железистыми клетками аденогипофиза.
Наилучшие результаты получаются при сочетании экологического и физиологического методов стимулирования половой функции производителей осетровых. Сочетание осуществляется в следующей последовательности: вначале производителей выдерживают в специальных водоемах, а затем производят гипофизарную инъекцию.
Отсадочные хозяйства для выдерживания производителей
Производителей выдерживают в специальных водоемах, предназначенных для отсадки рыбы. Существует два основных типа отсадочных хозяйств. Один из них сконструирован проф. Б. Н. Казанским, второй — куринскими рыбоводами (садковое хозяйство куринского типа).
Береговое отсадочное хозяйство конструкции Б. Н. Казанского. В садковом хозяйстве конструкции Б. Н. Казанского имеются земляные пруды для длительного резервирования и расположенные вблизи них бетонные садки-бассейны, предназначенные для кратковременного содержания производителей.
Самок и самцов содержат раздельно.
Земляной пруд состоит из двух частей: основной, расширенной, имеющей глубину до 2,5 м, и суженной, более мелкой части с глубиной 0,5—1 м. В этой части пруда создаются условия, имитирующие подход к нерестовому плесу. В расширенной части с большей глубиной условия приближаются к режиму зимовальных ям.
Пруд для самок имеет следующие размеры: длина 130 м (расширенная часть 100 м и суженная 30 м), ширина 20—25 м в расширенной части и 4—6 м в суженной. Дно расширенного участка земляное, а в суженном вымощено мелким гладким булыжником на обедненном бетоне; на месте стыка расширенной и суженной частей рассыпана галька.
Самцов содержат в прудах более простой конструкции. Эти пруды не имеют суженной части. В таком водоеме можно проводить в случае необходимости и зимовку производителей. Длина пруда для самцов 120 м, ширина по дну 5 м, глубина 2,5 м, уклон откоса 1:3.
Водоснабжение прудов механическое, водовпуск имеет вид железобетонного лотка или трубы. Сброс воды осуществляется через водоспускное сооружение, обеспечивающее как полное осушение пруда, так и возможность спуска различных горизонтов воды. Уровень воды регулируется шандорами. Постоянный расход воды 30 л/с может быть увеличен до 300 л/с.
Садковое хозяйство куринского типа. Представляет собой земляной пруд размером 75×12 м, разделенный на три участка с помощью бетонного перегораживающего сооружения, в середине которого устроено отверстие для установки затвора.
На первом участке длиной 105 м и глубиной 3 м производится длительное выдерживание производителей — от 1 до 1,5 мес. Заполнение водой продолжается 10—12 ч, а сброс 5—6 ч.
При наступлении нерестовых температур производителей переводят на второй участок, представляющий собой овальный бетонный бассейн с вертикальными стенками. В бассейне длиной 7 м, шириной 5 и глубиной 1 м производится предварительное кратковременное выдерживание самок и самцов до инъекции (1—3 сут). Переход из первого во второй участок осуществляется в форме плавного подъема: орудия лова — волокуши, которыми отлавливают производителей, подтягивают по специальным направляющим электролебедками с дистанционным управлением. Второй участок заполняется водой за 30 мин.
На третьем участке производителей инъецируют и выдерживают после гипофизарной инъекции. Этот участок имеет 2 бетонных бассейна с вертикальными стенками. Длина бассейна 5 м, ширина 3,5, глубина 1 м. На заполнение и сброс воды отводится по 15 мин. Над бассейном устраивается навес. Пересадка производителей из второго на третий участок, а также доставка их в операционное отделение, где получают икру, производится самоходным электротельфером в люльках.
Ранней весной из отстойника подают более теплую воду, что позволяет инъецировать рыбу в более ранние сроки. В бассейнах производители находятся 1—3 сут. Подача и сброс воды из бассейнов независимые. Вода подается с помощью трубы (флейты), расположенной поперек бассейна. Струи воды из флейты направлены в противоположные стороны. В результате такой подачи воды улучшается кислородный режим.
В бассейн сажают по 50 производителей белуги, по 80 — осетров или шипа и по 100 — севрюги. Расход воды в бассейнах 30 л/с. Третий участок огораживается штакетным забором, вокруг которого сажают деревья.
Заготовка производителей
Для более эффективного использования производителей при рыборазведении большое значение имеет знание внутривидовых биологических групп.
Изучение стад отдельных видов рыб дало возможность акад. Л. С. Бергу установить у некоторых из них наличие внутривидовых биологических групп. Дальнейшая разработка этого вопроса принадлежит проф. Н. Л. Гербильскому.
Учение о внутривидовых биологических группах основано на признании факта внутривидовой биологической разнокачественности, присущей всем видам животных и растений. У рыб она связана прежде всего с процессом размножения и установить ее можно, зная сроки и места нереста, различия в половом цикле, нерестовые температуры, состояние производителей в период их захода в реки, сроки пребывания производителей в реке перед нерестом.
Биологический анализ стада осетровых позволяет выбрать правильное местоположение рыбоводных заводов, помогает выяснить сроки отсадки и выдерживания производителей, а также решить вопрос о возможности получения от них зрелых половых продуктов в низовьях реки и двукратного использования прудов для выращивания молоди в течение одного вегетационного периода. Зная внутривидовые биологические группы, можно установить сезонный график, который позволяет наиболее рационально использовать водоемы и оборудование рыбоводных предприятий.
В качестве примера приведем биологические группы куринского осетра.
Профессора Н. Л. Гербильский и Б. Н. Казанский установили, что при скрещивании производителей осетра разных биологических групп его жизнестойкость в течение эмбрионального периода повышается.
Автором выявлено, что молодь, полученная от скрещивания производителей осетра разных биологических групп, по многим важным рыбоводным показателям превосходит молодь от родителей, принадлежащих к одной биологической группе: она более интенсивно питается и быстрее растет, у нее выше показатель упитанности, более высокое содержание протеина и зольных элементов.
Заготовка для рыбоводных целей производителей осетра, относящихся к разным биологическим группам, осуществляется в различные сроки.
Так, раннего ярового осетра заготовляют в дельте Волги во второй половине апреля — начале мая и используют для получения зрелых половых продуктов после краткосрочного резервирования в мае. Заготовку озимого осетра осеннего хода осуществляют в октябре, а получают от него икру и сперму после длительного выдерживания во второй половине апреля следующего года.
Имеется несколько рекомендаций для определения зрелых производителей. Так, М. Ш. Гусейнов рекомендует обращать внимание на их внешний вид:
- самки, близкие к овуляции, имеют тонкую тешу, у менее зрелых рыб она очень толстая и жирная;
- у зрелых рыб хвостовой стебель (от заднего края спинного плавника до начала хвостовой лопасти) имеет в поперечном разрезе овальную форму, т. е. его высота значительно больше ширины, что указывает на похудание рыбы. У менее зрелых рыб хвостовой стебель толще и менее высок;
- у зрелых особей рыло заострено в результате похудания, у менее зрелых рыб рыло и вся голова более толстые;
- жучки у зрелых рыб менее острые, кожа больше покрыта густой слизью.
Для того чтобы ориентироваться на эти признаки, надо иметь большой опыт работы с производителями.
А. Е. Андронов (1979) разработал способ отбора самок севрюги, основанный на измерении икринок. Среди самок севрюги, мигрирующих в реку, содержится много недостаточно зрелых рыб, в гонадах которых много недоброкачественной мелкой икры, поэтому нужно отбирать самок с наиболее крупной икрой. Икринки измеряют с помощью щупа, имеющего шкалу с ценой деления 2 мм и отметкой нуля на расстоянии 31 мм от начала прорези с диаметром 3 мм. У самок, отбираемых для рыбоводных целей, 15 икринок должны составлять ряд, оканчивающийся не менее чем на втором делении по шкале щупа.
Второй вариант отбора самок севрюги состоит в выяснении степени поляризации (крайнего положения) ядра. Вынутую щупом икру помещают в жидкость Серра (6 частей формалина, 3 части спирта, 1 часть ледяной уксусной кислоты), промывают водой и разрезают безопасной бритвой по анимально-вегетативной оси.
Положение ядра в икринках оценивается под лупой 7×10 по расстоянию от ядра до оболочки анимального полюса. Хорошими считаются самки севрюги, у которых ядро отошло от своего первоначального положения на расстояние, не превышающее радиуса икринки.
Научный сотрудник Азовского научно-исследовательского института рыбного хозяйства Л. В. Баденко разработала метод отбора производителей по физиологическим показателям, позволяющий более объективно судить о ценности производителей для рыбоводных целей. В основе метода лежит тот факт, что осетровые в период нерестовых миграций входят в реки в различном физиологическом состоянии. Это объясняется как неодинаковой зрелостью половых продуктов, так и разным уровнем накопления у них в организме запасных веществ. Так, по данным Л. Ф. Голованенко, истощенные производители, не пригодные для получения икры и спермы, а также особи, имеющие половые продукты в IV незавершенной стадии зрелости, нуждаются в резервировании, а рыбы в IV завершенной стадии могут быть инъецированы сразу после заготовки на местах добычи.
Совершенно ясно, насколько важно осуществить оценку производителей, отбираемых для рыборазведения. Это легче всего сделать путем исследования крови. Оказалось, что наиболее четкий ответ на вопрос о качестве производителей могут дать такие показатели, как содержание гемоглобина и состав белка сыворотки крови. По ним Л. В. Баденко и рекомендует отбирать производителей.
В начале нерестового хода самки имеют значительный уровень содержания жира и белка, у них высокие показатели обмена вещества и дыхания, поэтому таких рыб надо заготавливать в первую очередь. Обычно они имеют показатели содержания жира, белка, обмена вещества и дыхания, характерные для рыб, полностью отдающих зрелую икру.
Заготовку производят из неводных уловов, отбирая производителей оптимальной для работы массы (не более 15—20 кг для осетра и севрюги и 100 кг для белуги), не имеющих травм, кровоподтеков и т. п.
При определении массы рыбы взвешивать отобранных производителей на десятичных весах на приемном пункте запрещается, так как взвешивание без воды отрицательно влияет на состояние рыбы. Массу следует определять по специальной таблице, в которой приведены данные по соотношению длины тела и массы.
Большое значение имеет и возрастной подбор производителей. По данным А. А. Поповой, лучшее потомство дают осетры, пришедшие на нерест во второй и третий раз.
Производителей заготавливают с таким расчетом, чтобы иметь резерв на случай отходов в период транспортировки и выдерживания: у белуги и севрюги от 20 до 30% и у осетра от 10 до 30% от общего количества заготовленных производителей.
Производители отбираются непосредственно из притоняемого невода. Их по одному осторожно помещают в брезентовые носилки и переносят в небольшое живорыбное судно (матенку), в которое можно собирать не более 10 особей. Матенку доставляют к большому живорыбному судну, в котором производителей доставляют на осетровый рыбоводный завод. В несамоходную живорыбную прорезь астраханского типа сажают 5 белуг или 10 осетров, столько же шипов или 16 севрюг. Длина прорези астраханского типа 13 м, ширина 5 м и глубина 0,8 м, норма загрузки: один осетр на 1,5—2 м 3 , одна севрюга на 1 м 3 и одна белуга на 5—7 м 3 . Для предотвращения травмирования рыб шпангоуты прорези обшивают строгаными досками.
Доставленных на рыбоводный завод производителей поднимают на причал с помощью специального крана грузоподъемностью 500 кг. Рыбу транспортируют в наполненной водой брезентовой люльке, подвешенной к металлическому трубчатому каркасу. Ее сверху закрывают брезентовым фартуком.
Поднятую на причал люльку сразу же устанавливают на трубчатую подставку в кузове автомашины или самоходного шасси и транспортируют к пруду. Люльку также можно передвигать монорельсовым электротранспортом. Затем по наклонной плоскости люльку вместе с рыбой спускают в водоем. Рыбу можно транспортировать и выгружать также при помощи монорельсового пути и грузовой тали. При таком способе транспортировки люльку с производителями снимают с шасси талью, перемещают над прудом и затем опускают. Монорельсовые пути с электротельфером используют также для внутризаводских перевозок производителей.
Из прудов производителей отлавливают волокушей (отцеживающее орудие лова), оснащенной плавом и грузилами. Плав представляет собой поплавки из пенопласта, посаженные по верхней подборе. К нижней подборе прикрепляют грузила из обожженной глины. К концам крыльев привязывают деревянные бруски — клячи. Длина волокуши на 40—50% больше ширины пруда, а высота на 30—40% превосходит наибольшую глубину водоема.
Рыбу обычно отлавливают за одну продольную тоню. Тянут невод за урезы по обоим берегам водоема. Притонение производят на мелководном участке в головной части пруда. Место притонения укрепляется с помощью каменисто-галечной отсыпки. К этому участку подводят тельферный подвесной путь для механизации подъема производителей.
Отловленных производителей укладывают в люльку или на носилки и подносят к тельферу, который доставляет рыбу к садкам, где производителей инъецируют.
После использования волокуши развешивают для просушки на вешалах.
Заготовка гипофизов
Гипофизы лучше всего заготавливать весной, в период хода производителей. В это время половые продукты рыб находятся в IV завершенной стадии и в гипофизах накапливается максимальное количество гормонов.
Заготавливать гипофизы от отнерестившихся рыб нельзя, поскольку ранее содержавшиеся в них гормоны в период размножения полностью расходуются. Нельзя использовать для заготовки и гипофизы от неполовозрелых рыб. Вместе с тем Т. И. Фалеева отмечает, что гипофизы можно заготавливать осенью и зимой.
Для извлечения гипофиза вскрывают череп живой или свежей рыбы трепаном, сделанным из стали и представляющим собой металлический стержень, снабженный рукояткой. На нижний конец стержня насажен цилиндр, который можно передвигать по вертикали вдоль стержня и закреплять при помощи винта. У основания цилиндра имеются наточенные и разведенные зубцы, врезающиеся в ткань при вращении трепана. Его диаметр равен 30 мм. Для получения гипофиза от белуги применяют трепаны больших размеров диаметром 35—40 мм.
Трепан устанавливают посередине головы рыбы, позади глаз. Для точной установки трепана цилиндр поднимают вверх до отказа, вследствие чего нижний заостренный конец стержня выдвигается за край цилиндра. После этого вращают рукоятку и, сделав несколько оборотов, приподнимают стержень во избежание разрушения гипофиза. Затем трепан ввинчивают до отказа и вырезанную пробку, состоящую из кости и хряща, удаляют. В черепной крышке образуется отверстие, которое при правильной установке трепана находится над гипофизарной ямкой. Для получения гипофизов используют также электротрепан, представляющий собой электрическую дрель, что намного облегчает и ускоряет заготовку гипофизов.
Из полости черепа удаляют мозг и жидкость. Подготовительные операции на этом заканчиваются и можно приступать к извлечению гипофиза.
Гипофиз извлекают применяемой в хирургии ложкой Фолькмана, имеющей острые края и длинную ручку. Ни в коем случае нельзя брать пинцетом ткань железы, так как можно разрушить гипофиз и сделать его непригодным для инъецирования. С помощью ложки Фолькмана гипофиз легко можно вынуть и перенести в сосуд. Извлеченный гипофиз обезжиривают и обезвоживают, для чего в сосуд с хорошо закрывающейся крышкой (бюкс) наливают ацетон. После извлечения каждого гипофиза заготовитель помещает его в ацетон. После того как все гипофизы извлечены, их помещают в новую порцию ацетона на 12 ч, затем его еще раз сливают и наливают новую порцию, в которой через 6—8 ч происходит обезжиривание. Извлеченные из бюкса гипофизы просушивают на фильтровальной бумаге.
Для обработки гипофизов можно применять только безводный, химически чистый ацетон. Объем ацетона должен в 10—15 раз превышать массу заложенных в него гипофизов. Повторное использование насыщенного водой ацетона недопустимо.
Для длительного хранения высушенные гипофизы помещают в полиэтиленовые мешочки и этикетируют.
Желательно в отдельные мешочки подбирать гипофизы одной массы с тем, чтобы в полевых условиях на рыбоводном пункте можно было точно рассчитать применяемые дозировки.
Заготовку гипофизов следует производить централизованно сразу для нескольких заводов с определением гонадотропной активности выпускаемого препарата с помощью тест-объектов.
Централизованная заготовка опытными специалистами позволяет обеспечить высокое качество гипофизов и возможность применения оптимальных доз.
Определение качества гипофизов
Для определения количества гормонов, находящихся в гипофизах, и качества получаемых препаратов осуществляют биологическое тестирование, которое сводится к выяснению различных реакций органов животных, получивших инъекцию исследуемых препаратов. Обычно для биологического тестирования используют вьюна и лягушек.
Вьюн после введения гипофиза всегда дает количественно определяемую четкую реакцию. Определение единицы активности гипофиза рыб производят с помощью установленного Б. Н. Казанским понятия вьюновой единицы (в. е.).
Вьюновая единица — это такое количество гонадотропного гормона, которое необходимо, чтобы вызвать через 50—80 ч после инъекции созревание икры и овуляцию у зимних самок вьюна IV стадии зрелости массой 35—45 г при температуре воды 16—18°С в лабораторных условиях.
В целях выяснения активности исследуемого препарата гипофиза во вьюновых единицах нескольким группам самок одновременно производят гипофизарные инъекции с различными дозами гипофиза. Наименьшая доза, вызвавшая созревание, и соответствует вьюновой единице. Зная ее, можно сравнивать содержание гонадотропного гормона в различных гипофизах.
Использование вьюнов в качестве тест-объектов затрудняется в связи с ограниченностью их распространения в естественных водоемах.
Более доступным объектом являются лягушки. Их легко можно получать в необходимых количествах в любое время года. Положительной реакцией у лягушек служит появление подвижных сперматозоидов в клоаке после введения суспензии гипофиза в спинные лимфатические мешки. Эта реакция наступает очень быстро — через 40—50 мин. В этом состоит второе преимущество работы с лягушками по сравнению с вьюнами.
Лягушек-самцов заготавливают поздней осенью в местах их концентрации для зимовки. Содержат их в воде при температуре 1,5°С, слабой проточности и небольшой освещенности.
Тестирование препарата следует осуществлять ежегодно в одни и те же сроки. Так, в дельте Волги это делают в первой половине марта.
Лягушек выводят из зимнего состояния, медленно повышая температуру воды и доводя ее через неделю до 16—18°С. Тестирование дает лучшие результаты при температуре 18—23°С.
Проверку производят следующим образом. Вначале отбирают партии по 8—10 гипофизов, отличающихся цветом и величиной. Затем их взвешивают на аналитических весах с точностью до 0,1 мг. Взвешенный препарат растирают в ступке, постепенно увлажняя до получения однородной сметаноподобной консистенции. Затем в препарат добавляют физиологический раствор, и суспензия готова для инъецирования.
Инъекцию производят одновременно 5 лягушкам. Всего испытывают 3 группы лягушек. Каждую группу инъецируют определенной дозой: 0,2; 0,3 и 0,4 мг сухого препарата гипофиза.
Показателем биологической активности испытуемого препарата гипофиза является минимальная весовая доза, вызывающая реакцию спермации более чем у половины проинъецированных лягушек. Биологическую активность препарата рассчитывают путем деления единицы на весовой показатель минимальной эффективной дозы.
Одна лягушечья единица (л. е.) — это активность минимальной весовой дозы препарата, вызывающая спермации у самца лягушки.
Ацетонированный препарат гипофиза должен иметь стандартную, заранее известную активность, которая равна 3,3 лягушачьих единицы.
Использование препарата позволит расходовать заготовленные гипофизы более экономно. Кроме того, в тех случаях, когда после проведения гипофизарной инъекции созревание производителей не наблюдается, облегчается анализ причин этого явления.
Следует также иметь в виду, что дозу вводимого препарата на единицу массы производителей нужно рассчитывать с учетом биологической активности каждой данной партии гипофизов.
Кроме вышеизложенной методики определения активности ацетонированных гипофизов существует несколько других методов такой проверки. В частности, Б. Ф. Гончаров предложил для определения качества гипофизов использовать систему созревания икринок вне организма. Проверка осуществляется следующим образом. Щупом берется проба икры и помещается в физиологический раствор с 0,1%-ным раствором кристаллического альбумина. Туда же добавляется суспензия гипофиза. Если самка подготовлена к созреванию, то зародышевый пузырек растворяется.
Преимущества предлагаемого метода состоят в том, что он является чувствительным, дает возможность получать большой цифровой материал и его можно использовать непосредственно на рыбоводных заводах в сезон проведения работ с производителями.
При этом методе доза вводимого гипофиза рассчитывается в миллиграммах ацетонированного гипофиза на 1 кг массы производителя или в миллиграммах на одного самца или одну самку.
Правильная дозировка во многом предопределяет качество получаемых половых продуктов. Если доза окажется недостаточной, созревание производителей не произойдет. При увеличенной дозе гормонального препарата снижается качество икры или спермы.
При более низких температурах (в пределах диапазона нерестовых температур) для созревания производителей необходимы более высокие дозы препарата, при температурах, близких к верхней границе нерестовых температур, количество гормонального препарата снижается. Для созревания самцов по сравнению с самками нужно вводить меньше гормонального препарата.
Осетровые рыбоводные заводы получают ацетонированные гипофизы с заранее определенной гонадотропной активностью. Однако она не всегда остается постоянной. При хранении гипофизов более года их гонадотропная активность снижается. Процесс ухудшения качества гипофизов замедляется при их хранении в герметически закрытой посуде в сухом помещении при низкой температуре.
Гипофизарная инъекция
Высушенный гипофиз в чистой стеклянной или фарфоровой ступке растирают пестиком в порошок, затем взвешивают необходимую дозу на аналитических или торзионных весах для каждой партии инъецируемых производителей раздельно для самок и самцов.
Взвешенную дозу вносят в физиологический раствор (6,5 г химически чистой поваренной соли, растворенной в 1 л дистиллированной воды) и еще немного растирают. Затем к этой массе добавляют еще одну порцию физиологического раствора в таком количестве, чтобы на одного производителя приходилось 2 см 3 суспензии. Затем ее несколько раз тщательно взбалтывают с помощью шприца и переносят в склянку с широким горлышком и притертой пробкой.
Перед началом инъецирования содержимое склянки еще несколько раз тщательно перемешивают. Суспензию шприцем вводят в мышцы спины. После инъекции иглу осторожно вынимают. Место прокола кожи прижимают пальцем, а затем немного массируют. Это нужно делать во избежание вытекания введенного препарата.
При температуре воды ниже нерестовой на 2—3°С дозу гипофиза увеличивают на 30—50%.
Гипофизарные инъекции дают положительные результаты лишь при завершении у производителей IV стадии зрелости половых продуктов. Показателем такого состояния яйцеклеток служит смещение имеющихся у них ядер к каналу (микропиле), через который сперматозоид проникает в икринку.
Четвертая стадия у самцов характеризуется завершенностью процесса образования спермиев. У таких самцов преобладают зрелые, вполне сформированные сперматозоиды.
Хорошие результаты дают однократные инъекции ацетонированного препарата. Вместе с тем иногда они оказываются недостаточно результативными. Такое положение, наблюдается, когда общее состояние производителей ухудшено или развитие икры полностью не завершено. При такой ситуации иногда целесообразно производить повторные инъекции небольших доз препарата. Однако всегда надо помнить, что увеличенные по сравнению с научнообоснованными дозы препарата гипофиза приводят к снижению качества получаемых зрелых половых клеток. Объясняется это тем, что в порошке ацетонированного гипофиза содержатся и такие гормоны, которые не нужны непосредственно для созревания половых клеток. В результате создаются побочные эффекты, организм приходит в состояние большого напряжения (стресса).
Успешное проведение гипофизарных инъекций во многом зависит от того, как содержатся производители. На всех этапах этой операции — перед, во время и после введения в тело рыбы препарата гипофиза — с самками и самцами следует обращаться очень бережно, не допускать их травмирования. В водоемах, предназначенных для производителей, должен быть хороший кислородный режим, самок и самцов следует содержать раздельно. Перед инъецированием их переводят в небольшие бетонированные бассейны или садки, в которых создают оптимальные условия для того, чтобы гарантировать созревание половых продуктов после введения в тело гормонального препарата.
Определение времени созревания производителей
После введения гипофиза у рыб начинается период созревания (до получения зрелой икры), длительность которого зависит от температуры воды и исходного состояния самок.
А. С. Гинзбург и Т. А. Детлаф установили, что при одинаковой средней температуре период созревания всегда намного короче периода зародышевого развития (в 4—6 раз). Отсюда следует, что при повышении или понижении температуры соответственно изменяется продолжительность периодов созревания и зародышевого развития. Выявление такой закономерности позволило А. С. Гинзбург и Т. А. Детлаф построить графики вероятных сроков созревания самок осетровых при различной температуре в зависимости от продолжительности их зародышевого развития.
На графиках нанесены кривые, указывающие время, когда после гипофизарных инъекций можно ожидать созревание самок. По графикам также можно определить сроки просмотра самок и взятия проб, высчитав сначала среднюю температуру за период созревания.
Расчет производится так. В 19 ч накануне дня получения икры и в 7 ч утра в день взятия икры высчитывается средняя температура, начиная со времени инъекции производителей. Затем на горизонтальной оси находят точку, соответствующую средней температуре за период созревания, и восстанавливают из нее перпендикуляр до пересечения с кривыми. Точка пересечения с кривой показывает, через сколько часов созревают первые самки. Полученное число часов добавляют ко времени инъекции и выявляют время начала просмотра самок. Точка пересечения с кривой дает возможность таким же образом определить сроки созревания многих самок.
Пользуясь этим графиком, можно определить сроки инъекции суспензии гипофизов самкам осетровых, чтобы получать икру в удобное для работы время. В результате облегчается работа с производителями, сокращается число необходимых просмотров самок, повышается качество икры, а также сокращаются потери в результате ее перезревания или недозревания.
При расчете требуемого показателя вначале определяют среднюю температуру за сутки до инъекции. Затем на горизонтальной оси графика созревания самок находят точку, соответствующую этой температуре, и восстанавливают из нее перпендикуляр до пересечения с кривой. Из точки пересечения опускают перпендикуляр на вертикальную ось и определяют по ней число часов, которое пройдет при данной средней температуре от инъекции до созревания первых самок. Высчитанное таким образом число часов отнимают от времени начала рабочего дня и получают то время, когда надо инъецировать самок.
Метод определения степени зрелости половых желез самок без вскрытия рыбы предложил также В. З. Трусов. Этот метод сводится к тому, что у самок с помощью щупа из яичника извлекают несколько икринок. Пинцетом их переносят в пробирку с формалином. Пробирки вносят в помещение, где установлен замораживающий микротом. Икринки размещают на столике так, чтобы срезы микротомной бритвы проходили через их анимальный и вегетативный полюса. Затем икринки заливают из глазной пипетки водой, после чего покрывают столик металлическим колпаком и замораживают срезы, добавляя из баллона углекислый газ.
Срезы делают до тех пор, пока не появится хорошо видимое невооруженным глазом или под лупой ядро. Если оно лежит вплотную к оболочкам, то состояние половой железы самки находится в IV завершенной стадии зрелости.
Метод определения степени зрелости половых желез самок, предложенный В. З. Трусовым, сравнительно прост, надежен и занимает мало времени: анализ одной пробы можно осуществить за 5—8 мин.
Созревание самок контролируется также путем непосредственного наблюдения. Контроль усиливается в течение последних шести часов — наиболее вероятного при данной температуре срока созревания.
Еще более простой экспресс-метод определения зрелости гонад у производителей осетровых разработали проф. Б. Н. Казанский, Ю. А. Феклов, С. Б. Подушка и А. Н. Молодцов. Сущность метода состоит в том, что с помощью щупа из задней части яичника берут пробу икры, щуп вводится в полость тела под углом 30°, что позволяет не задевать жизненно важные органы. Щуп имеет наконечник, заполняемый икрой, и стержень, обеспечивающий его опорожнение.
Общая длина щупа — 125 мм, наконечника — 65 мм, в том числе заостренной части — 20 мм. Наружный диаметр стержня — 4,5 мм. Щуп заканчивается ручкой, расположенной перпендикулярно стержню. Извлеченные щупом икринки для выяснения степени завершенности IV стадии зрелости в течение 2 мин кипятят. Отвердевшие икринки разрезают лезвием безопасной бритвы по оси от анимального полюса к вегетативному. Срезы рассматривают под лупой или бинокуляром. Степень поляризации яйцеклетки определяют положением ядра относительно анимального полюса. Показатель поляризации определяют по формуле, предложенной Ю. А. Фекловым: l = А/В, где l — показатель поляризации; А — расстояние от ядра до оболочки; В — наибольшее расстояние по оси от анимального до вегетативного полюса.
Чем меньше значение l, тем больше поляризована яйцеклетка и тем больше завершенность IV стадии зрелости гонад. Наибольшая поляризация ооцита наблюдается при l = l/30 : l/40.
Если брюшко самки при прощупывании оказывается более мягким, чем было до инъекции, то это свидетельствует о возможном созревании икры у данной особи. Чтобы в этом удостовериться, под самку следует подвести рыбоводные носилки с водой, приподнять их и установить на козлы. В это время рыба делает резкие движения, и если икра созрела, то на носилках можно заметить выделившиеся икринки. После того как самка успокоится, ее поворачивают на бок и ощупывают брюхо. У созревшей особи при массировании задней трети брюха струей свободно вытекает икра.
Таким образом, как отмечают А. С. Гинзбург и Т. А. Детлаф, показателями к вскрытию самок служат мягкое брюшко, выбивающаяся сильной струей икра, западание брюшной стенки при подъеме самки.
От полностью созревшей самки необходимо сразу же получить икру.
Получение зрелой икры
Работу по получению зрелых половых продуктов, включая взятие, оплодотворение и отмывку, икры, проводят в операционном отделении, которое обычно находится в инкубационном цехе. В нем имеется такое оборудование для получения половых продуктов, как лебедка, фиксатор, холодильная камера (КХ-6Б), в которой хранят производителей уже без икры и спермы (икра и сперма получены перед их сдачей на заготовительный пункт). В операционном отделении размещают производственные столы размером 126x84x90 см типа СПСМ-4.
Созревшую самку оглушают сильным ударом деревянной колотушки по носу, после чего ее обескровливают, перерезая хвостовую или жаберные артерии, обмывают водой и вытирают. Чтобы кровь не попала в таз с икрой, место разреза забинтовывают. Готовую к вскрытию рыбу поднимают за голову через перекладину или блок и закрепляют. Брюшко надрезают снизу вверх от полового отверстия на 15—20 см. Разрез делается неглубоким и немного сбоку от средней линии. Чтобы избежать возможных потерь икры, хвост самки придерживают над тазом. Часть созревшей икры свободно вытекает в таз по его краю. После этого брюшко разрезают до грудных плавников и оставшуюся, свободно отделяющуюся икру переносят в таз. Можно также использовать для оплодотворения доброкачественную икру, имеющуюся в яйцеводах.
Количество получаемой икры зависит от массы самки.
Икру от разных самок не смешивают. Все операции с икрой проводят с предельной осторожностью. Икру можно собирать только в тазы с неповрежденной эмалью. В таз вместимостью 12—15 л помещают не более 2 кг икры.
Оплодотворяют только полноценную зрелую икру, которую надо уметь определять.
Недозревшие икринки отличаются от зрелых одинаковой окраской всех участков. Созревшие икринки очень медленно обесцвечивают водный раствор метиленовой сини. Недозревшие икринки этот раствор совсем не обесцвечивают, а перезревшие обесцвечивают значительно быстрее, чем созревшие. Такой способ определения рыбоводного качества икры осетровых разработан доцентом Ленинградского государственного университета М. Ф. Вернидуб. Он сводится к следующему: 2 см 3 икры (без полостной жидкости) помещают в бюкс или плотно закрывающуюся пробирку, заполненную 10 см 3 свежеприготовленного раствора метиленовой сини (одна капля 0,05%-ного водного раствора краски на 10 см 3 воды), несколько раз встряхивают и учитывают время, в течение которого произойдет обесцвечивание раствора.
В отдельных случаях обесцвечивание в сроки, обычные для икры данного качества, не происходит.
Определение готовности икры к оплодотворению
Сотрудник Азовского научно-исследовательского института рыбного хозяйства Л. Т. Горбачева предложила оценивать готовность икры к оплодотворению в заводских условиях по скорости наступления клейкости оболочек икры после ее оплодотворения.
Для того чтобы установить, когда следует начать осеменение икры, уже извлеченной из полости тела самки, берут 100—150 икринок, осеменяют спермой и определяют время, в течение которого икра в пробе приклеивается к чашке Петри. После этого по специальному графику устанавливают время, когда следует осеменять всю икру. Для икры осетра лучшим для оплодотворения считается состояние, при котором за 9—16 мин приклеивается не менее 90—95% всех оплодотворенных икринок; для икры севрюги это состояние соответствует времени 6—10 мин. Такая икра развивается нормально.
Перезревшая икра осетра начинает приклеиваться через 4—6 мин, а севрюги — через 2—4 мин. Такая икра в период инкубации дает повышенный отход.
Для оплодотворения используют икру только высокого качества, показателями которого являются: